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    • 专利摘要:

    公开号:WO1986004919A1
    申请号:PCT/CH1986/000018
    申请日:1986-02-12
    公开日:1986-08-28
    发明作者:Ulrich C. Knopf
    申请人:Agrogen-Stiftung；
    IPC主号:C12N5-00
    专利说明:
    [0001] Verfahren und Vorrichtung fuer die in-vitro-Kultur von Pfl anzen-zellen und -organen, sowie fuer die Mikropropagation und die Regeneration von ganzen
    [0002] Pfl anzen
    [0003] Methoden fuer die in-vitro-Kultur von Pflanzen-Zellen, Pflanzen-Organen, sowie fuer die Mikropropagation und Regeneration in vitro von ganzen Pflanzen werden heute in verschiedenen Laboratorien verwendet um Zier-, Nutz- und Medizinal -Pflanzen zu vermehren, oder auf diesem Wege zu verbessern. In vitro kultivierte Zellen werden zudem fuer die Produktion von pflanzlichen Metaboliten (Sekundaerstoffen), fuer Biotransformationen (Umwandlung von chemischen Stoffen unter Benuetzung lebender Zellen) und zum Testen von verschiedenen Agro-Chemikauen (Herbizide, Fungizide, Anti-Virus Stoffe usw.) verwendet.
    [0004] In den meisten Laboratorien erfolgt die in-vitro-Kultur von Pflanzenzellen oder -organen auf mehr oder weniger komplexen Naehrboeden die mit Agar oder Agarose zu einem Gel verfestigt sind, oder aber, z.B. als Suspensionskulturen, in fluessigen Naehrloesungen (vergl. dazu z.B. Street H.E., Plant Tissue and Cell Culture, 2nd edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1977). Es wurde nun gefunden, dass mittels einer neuen Methode auf die Verfestigung des Naehrmediums mit Agar oder Agarose verzichtet werden kann, wobei aber die Zellen- im Gegensatz zur Suspensionskultur, trotzdem hauptsaechlich in der gasfoermi gen Phase kultiviert werden. Das neue Verfahren, das Gegenstand der vorliegenden Erfindung bildet, besteht darin, dass man auf die Oberflaeche des fluessigen Naehrmediums frei bewegliche Schwimmkoerper aufbringt und die Pflanzenbestandteile an der Oberflaeche dieser Schwimmkoerper kultiviert. Gegenueber den bekannten Methoden hat das Verfahren gemaess der vorliegenden Erfindung die folgenden Vorteile: a) Die Verdampfung (bezw. Austrocknung) des Naehrmediums wird dank der die Oberflaeche bedeckenden Schwimmkugeln auf ein Minimum reduziert. Damit koennen die Transplantations-Intervalle fuer die Zeil-Kulturen betraechtlich erhoeht werden. In gewissen Faellen faellt dieser Arbeitsaufwand gaenzlich dahin, indem das fluessige Naehrmedium in den Kulturgefaessen bei Bedarf einfach ergaenzt werden kann. b) Das erfindungsgemaesse Verfahren erweist sich als besonders guenstig zum Anlegen von neuen Starter-Kulturen aus Samen und anderen Pflanzen-teilen. Die Infektion durch Mikroorganismen kann dabei stark reduziert werden. c) Das neue Verfahren eignet sich insbesondere auch zum Testen von Agrochemi kauen wie zum Beispiel Herbiziden, Pestiziden, etc. sowie fuer die Induktion von Resistenzen in Pflanzenzellen, zum Beispiel gegenueber Chemikalien oder Toxinen biologischen Ursprungs. Mit dem neuen Verfahren koennen Chemikalien oder Toxine schrittweise und in zunehmender Konzentration zu einer bereits angesetzten Kultur hinzugefuegt werden; arbeitsaufwendige Transplantationen der Kulturen werden dabei unnoetig. Zudem wird die gleichmaessige Verteilung der zugefuegten Chemikalien oder Toxine sehr vereinfacht. d) Wegen der Moeglichkeit, die sonst notwendigen Transplantationsschritte in verschiedene Naehrmedien zu reduzieren oder gaenzlich zu eliminieren, eignet sich das neue Verfahren vor allem auch fuer die Mikropropagation von ganzen Pflanzen, sowie die Regeneration von ganzen Pflanzen aus Zellen. e) Infolge des verminderten Arbeitsaufwandes und des Verzichts auf Agar und aehnliche Naehrbodenverfestiger ist das Verfahren preisguenstig. Die Schwimmkoerper koennen, nach Reinigung und gegebenenfalls Sterilisation, mehrmals verwendet werden. f) Das erfindungsgemaesse Verfahren eignet sich fuer die kontinuierliche Massenkultur von Pflanzen-zellen. Insbesondere bietet sie eine interessante Alternative in den Faellen, wo die Suspensionskultur von Zellen nicht moeglich oder wenig produktiv ist. Die Alternative ist auch von besonderem Interesse fuer die Produktion von Sekundaerstoffen oder fuer Biotransformationen durch pflanzliche
    [0005] Zellen.
    [0006] Die Schwimmkoerper im Sinne der vorliegenden Erfindung haben vorzugsweise die Form von Kugeln, die zur Erhoehung der Schwimmfaehigkeit auch hohl sein koennen. Geeignete Materialien zur Herstellung der Schwimmkoerper sind insbesondere polymere Kunststoffe wie Polyaethylen, Polypropylen, Polyisobutylen, oder Polystyrol.
    [0007] Neben dem Verfahren umfasst die vorliegende Erfindung auch die fuer dessen Ausuebung geeigneten Vorrichtungen, d.h. die zur Aufnahme der Naehrfluessigkeit und der Schwimmkoerper geeigneten Kulturgefaesse, die mit zusaetzlichen Vorrichtungen fuer den Zu- und Wegtransport von Fluessigkeiten oder Gasen, fuer deren Zirkulation im Gefaess, fuer die Regelung physikalischer und chemischer Groessen, wie Licht, Temperatur, Druck, Fluessigkeitsniveau, oder pH, sowie gegebenfalls einer raeumlichen Abgrenzung fuer die Schwimmkugeln ausgeruestet sein koennen.
    [0008] Die erfindungsgemaessen Vorrichtungen werden durch die beiden Figuren 1 und 2 erlaeutert, ohne dass dadurch die moeglichen Ausfuehrungsformen in irgendwelcher Weise eingeschraenkt werden sollen. Fig. 1 zeigt eine erfindungsgemaesse Vorrichtung in ihrer einfachsten Form: Im Kulturgefaess (2) in Form eines Reagensglases, das mittels des Stopfens (1) aus Kunststoff oder Baumwollwatte verschlossen ist, befindet sich die Naehrfluessigkeit (5), auf welcher eine Schwimmkugel (4) aus Polypropylen lose beweglich schwimmt. Auf der Oberflaeche dieser Schwimmkugel entwickelt sich die Pflanzenzellkultur (3). Fig. 2 zeigt ein mit verschiedenen Zusatzvorrichtungen ausgeruestetes
    [0009] Kulturgefaess, wie es sich fuer die Kultur von Pflanzenzellen und
    [0010] -organen, sowie von ganzen Pflanzen in groesserem Massstab eignet. In dem geschlossenen oder durch einen (in der Figur nicht gezeigten) keimdichten Deckel verschliessbaren Kulturgefaess befindet sich, dieses etwa zur Haelfte fuellend, die Naehrfluessigkeit (5), deren Oberflaeche von einer zweidimensional sich erstreckenden Schicht schwimmender Kugeln (4) aus Polypropylen praktisch vollstaendig bedeckt ist. Das Kulturgefaess ist mit einem Zulauf (9) und zwei verchiedenen Ablaeufen fuer die Naehrfluessigkeit ausgeruestet, wovon der eine (15a) auf der Hoehe der Fluessigkeitsoberflaeche, der andere (15b) am Boden des Gefaesses angebracht ist. Eine Ruehrvorrichtung (10) mit kombinierter Temperaturregelung und eine Vorrichtung zur Regelung des pH (11) sind in die Naehrfluessigkeit eingetaucht. Aus dem Gefaess (13) kann ein Gas, z.B. sterile Luft in den freien Raum ueber der Naehrfluessigkeit zugefuehrt werden. Der Stutzen (14) dient zur Ableitung des durch die Vorrichtung (13) eingefuehrten Gases oder auch des durch die Vorrichtung (8) eingefuehrten Sterilisationsmittels (z.B. Dampf oder heisse Luft). Ein Gitter (7) dient dazu, die Schwimmkugeln an der Fluessigkeitsoberflaeche zu halten und wenn noetig zu bewegen. Mittels der Beleuchtungsvorrichtung (12) koennen die sich auf den Kugeln vermehrenden Zellkulturen (3) oder ganzen Pflanzen (6) nach Bedarf bestrahlt werden. Fuer die in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen Versuche wurden Kulturgefaesse aus Glas, verschlossen mit Baumwolle- oder Kunststoffstopfen, bezw. bei groessereπ Gefaessen mit einem Deckel aus Kunststoff oder Aluminium verwendet. Die Gefaesse wurden vor Beginn der Versuche mit heissem Dampf (110°C, 1 atu) sterilisiert. Zur Sterilisation koennen gegebenenfalls auch radioaktive Strahlen, z.B.j-Strahlen verwendet werden. Den sterilisierten Gefaessen wurde anschliessend fluessige Naehrloesung zugegeben (fuer die Zusammensetzung geeigneter Naehrloesungen siehe z.B. Gamborg O.L., Murashige T.A., Thorpe A. und Vasil K., Plant Tissue Culture Media, In Vitro 12, 473 - 478, 1976). Die zu kultivierenden, zuvor gegebenenfalls sterilisierten Pflaπzenzellen oder -organe (inkl. Samen) wurden anschliessend auf die schwimmenden Kugeln aufgebracht. Als biologische Materialien fuer die nachfolgenden Beispiele verwendeten wir in vitro kultivierte Zellen (Kalli) und Organe der Luzerne (Medicaqo sativa), des Tabaks (Nicotiana tabacum), der Kartoffel (Solanum tuberosum), des Blumenkohls (Brassica oleracea) und des Weizens (Triticum aestivum). Das erfindungsgemaesse System eignet sich jedoch grundsaetzlich fuer Zellkulturen saemtlicher Pflanzenarten. Die Kulturen wurden waehrend mehrerer Wochen bezw. Monaten bei 28°C unter Kunstlicht mit verschiedenen Photoperioden, oder auch in der Dunkelheit, kultiviert.
    [0011] Beispiel 1: Anlage von neuen Zellkulturen
    [0012] Verschiedene Gewebe und Organe inkl. Samen der oben genannten Pflanzen wurden wie folgt sterilisiert: 1 - 3 Min. in Aethanol 70%, 1 Min. in dest. Wasser, 10 - 20 Min. in Natriumhypochlorit 5% waess. Loesung, gefolgt von mehrmaligem Waschen mit sterilem dest. Wasser. Die Gewebe und Organe wurden darauf in Reagensglaesern von 10 cm Laenge, 11 mm
    [0013] Durchmesser auf einer auf 3 ml Naehrloesung (85 (vergl. Gamborg et al. in: In Vitro 12, 473 - 478, 1976), enthaltend pro Liter: KNO3 2500 mg;
    [0014] CaCl2.2H2O 150 mg; MgSO4.7H2O 250 mg; (NH4)2SO4 134 mg; NaH2PO4.H2O 150 mg; KI 0,75 mg; H3BO3 3,0 mg; MnSO4.H2 10 mg; ZnSO4.7H2O 2 mg;
    [0015] Na2MoO4 .2H2O 0,25 mg; CuSO4.5H2O 0,025 mg; CoCl2.6H2O 0,025 mg;
    [0016] Na2EDTA* 37,3 mg; FeSO4.7H2 27,8 mg; Saccharose 20 g; Inosit 100 mg;
    [0017] Nicotinsaeure 1 mg; Pyridoxin-HCl 1 mg; Thiamin-HCl 10 mg; 2,4-D** 1 mg; pH eingestellt auf 5.5) schwimmenden Polypropylenkugeln von 10mm Durchmesser kultiviert, bis eine deutliche Kallusbildung oder Keimung der Samen erfolgte (* Aethylendiamin-tetraessigsaeure Dinatriumsalz
    [0018] Dihydrat; ** 2,4-Dichlor-phenoxyessigsaeure).
    [0019] Beispiel 2: Erhaltung von Zellkulturen und Mikropropagation von Pflanzen Die Versuche wurden in Reagensglaesern von 16 cm Laenge und einem
    [0020] Durchmesser von 25 mm, mit einer auf einer 20 ml Naehrloesung schwimmenden Polypropylenkugel (Durchmesser 20 mm) durchgefuehrt. Wo noetig wurde den Kulturen von Zeit zu Zeit frische Naehrloesung zugefuegt.
    [0021] Beispiel 3: Testen von Chemikalien (Herbizide, Pestizide etc.), Induktion von Resistenzen (gegen Chemikalien und Toxine) Zellkulturen wurden angelegt und erhalten wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben. Nachdem die Kalli eine gewisse Groesse erreicht hatten, wurden die Chemikalien z.B. Herbizide in rege!maessigen Zeitintervallen und zunehmender Konzentration zugegeben. Die ueberlebenden Kalli wurden selektioniert. Wo noetig wurde den Kulturen von Zeit zu Zeit frische Naehrloesung zugegeben, ohne dabei die Kalli zu transplantieren.
    [0022] Beispiel 4: Regeneration von Pflanzen aus Zellen und Organen Die Kalli wurden wie in Beispiel 2 beschrieben oder aber in Glasgefaessen von 5 cm Durchmesser und variabler Hoehe mit einer groesseren Anzahl auf der Naehrloesung schwimmender Polypropylenkugeln kultiviert. Um eine Regeneration der ganzen Pflanzen zu bewirken, wurden entweder die dazu notwendigen Chemikalien direkt ins Kulturgefaess zugegeben, oder die dazu noetige neue Naehrloesung wurde mit oder ohne Absaugen der alten Loesung zu den Kulturgefaessen zugegeben.
    [0023] Beispiel 5: Kontinuierliche Kultur von Pflanzeπzellen Fuer die kontinuierliche Kultur wurde eine Vorrichtung entsprechend der Figur 2 verwendet. Die Naehrloesung wurde periodisch oder kontinuierlich abgesaugt und durch frische Loesung ersetzt, ohne dabei das Niveau des Naehrmediums und der darauf schwimmenden Kulturen zu veraendern.
    权利要求:
    ClaimsPatentansprueche
    1. Verfahren fuer die in-vitro-Kultur von Pflanzeπzellen und -Organen, sowie fuer die Mikropropagation und Regeneration in vitro von ganzen Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur auf an der Oberflaeche eines fluessigen Naehrmediums schwimmenden Koerpern erfolgt.
    2. Verfahren gemaess Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die schwimmenden Koerper aus einem polymeren Kunststoff bestehen.
    3. Verfahren gemaess Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die schwimmenden Koerper die Form von Kugeln besitzen.
    4. Vorrichtung zur Durchfuehrung des Verfahrens gemaess einem der Ansprueche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einem vorzugsweise sterilisierbaren Gefaess zur Aufnahme der Naehrloesung und der darauf schwimmenden Koerper besteht.
    5. Vorrichtung gemaess Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Gefaess mit mindestens je einem Zu- (9) und Ablauf (15a, 15b) fuer Fluessigkeit ausgeruestet ist, die ober- oder unterhalb oder auf gleicher Hoehe wie das Fluessigkeitsniveau am Gefaess angebracht sind.
    6. Vorrichtung gemaess Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Gefaess zusaetzlich mit Vorrichtungen fuer die Zu- (13) und Abfuhr
    (14) eines Gases ausgeruestet ist.
    7. Vorrichtung gemaess einem der Ansprueche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Gefaess zusaetzlich eine Ruehrvorrichtung (10) enthaelt.
    8. Vorrichtung gemaess einem der Ansprueche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Gefaess zusaetzlich mit Vorrichtungen zur Regulierung der Temperatur (10) und/oder des pH (11) ausgeruestet ist.
    9. Vorrichtung gemaess einem der Ansprueche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet , dass das Gefaess mit einem unterhalb dem von den Schwimmkoerpern beanspruchten Niveau mit einem fuer die letzteren nicht durchlaessigen Gitter (7) ausgeruestet ist.
    10. Vorrichtung gemaess einem, der Ansprueche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Gefaess zusaetzlich mit einer auf die Kultur wirkenden Beleuchtungsvorrichtung (12) ausgetattet ist.
    11. Vorrichtung gemaess einem der Ansprueche 4 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Gefaess zusaetzlich mit einer Vorrichtung fuer die Sterilisation (8) ausgeruestet ist.
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    EP0215811B1|1989-10-18|
    DE3666458D1|1989-11-23|
    CH665217A5|1988-04-29|
    EP0215811A1|1987-04-01|
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    JPS62502374A|1987-09-17|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1986-08-28| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AU BR DK FI HU JP KR NO SU US |
    1986-08-28| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CF CG CH CM DE FR GA GB IT LU ML MR NL SE SN TD TG |
    1986-09-20| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1986901026 Country of ref document: EP |
    1986-09-25| CFP| Corrected version of a pamphlet front page|
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    1986-11-06| CFP| Corrected version of a pamphlet front page|
    1986-12-18| CFP| Corrected version of a pamphlet front page|
    1986-12-18| CR1| Correction of entry in section i|Free format text: IN PAT.BUL.19/86,UNDER INID (32) PRIORITY DATE REPLACE "14 FEBRUARY 1985(140285" BY "15 FEBRUARY 1985(150285) |
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    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    CH693/85-9||1985-02-14||
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